本罪主体为特殊主体，是指工厂、矿山、林场、建筑企业或者其他企业、事业单位的职工。这些单位既包括国家的，又包括集体的。作为本罪主体的上述单位的职工，并非该单位从事各种工作的职工，而是指那些直接从事生产的人员和直接指挥生产的人员，包括生产工人、技术员、安全员、化验员、检验员、生产调度、段长、矿长、车间主任等。而非生产性的工作人员，如党、团和工会的专职工作人员，以及资料员、收发人员、治安人员等，玩忽职守，造成严重后果的，均不构成本罪，但是，如果他们参加车间生产期间，违章造成重大伤亡事故，造成严重后果的，则构成本罪。此外，改革开放以来，随着个体经济的发展，个体经营户生产中因违章发生重大事故的案件开始增加，上述主体范围已不能适应现实情况，因此，1986年6月21日最高人民法院、最高人民检察院《关于刑法第114条规定的主体要件的适用范围的联合通知》中，将群众合作经营组织或个体经营户的从业人员也包括在重大责任事故罪的主体中。对于群众合作经营组织和个体经营户的主管负责人，在管理工作中玩忽职守，致使发生重大伤亡事故，造成严重后果的，也应按刑法第114条的规定，追究处罚。1988年3月18日，最高人民检察院《关于无照施工经营者能否构成重大责任事故罪主体的批复》指出，“无照施工经营者在施工过程中强令从业人员违章冒险作业，造成重大伤亡事故的，可以构成重大责任事故罪的主体要件。1989年4月3日最高人民检察院《关于在押犯能否构成重大责任事故罪主体的批复》指出，”在押犯是劳改企业中直接从事生产的人员，可以构成重大责任事故罪的主体。至于三资企业中的从业人员和生产管理人员能否成为重大责任事故罪的主体，现行立法和司法解释均未明确指出，但根据立法与司法解释的精神，应当认为他们可以作为重大责任事故罪的主体。